PROTEIN

Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui struktur, sifat-sifat asam-asam amino, peptide dan protein; mengetahui adanya ikatan peptida maupun sifat-sifat tertentu dari asam amino dengan menggunakan reaksi warna dan mengetahui hasil reaksi pengendapan protein oleh asam, reagen alkaloid, alkohol dan reaksi warna.

Tinjauan Pustaka

Sebagian besar ilmu kimia organisme hidup menyangkut 5 golongan senyawa utama, yaitu: karbohidrat, lipida, mineral, asam nukleat dan protein. Protein menentukan kebanyakan sifat-sifat yang ditemukan dalam kehidupan. Protein menentukan metabolisme, membentuk jaringan dan membertikan kemungkinan bagai kita untuk bergerak. Protein juga berfungsi mengangkut senyawa-senyawa dan melindungi kita dari penyebaran mikroorganisme yang merugikan.

Bahkan sifat-sifat yang diturunkan oleh suatu organisme untuk membentuk bermacam-macam jenis protein dengan kecepatan yang berbeda (Gilvery, 1996). Selain itu proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim, suatu protein yang berfungsi sebagai biokatalis. Di samping itu hemoglobin dalam butir darah merah (eritrosit) yang berfungsi mengangkut oksigen dari paru-paru ke seluruh jaringan tubuh adalah salah satu jenis protein (Riawan, 1990).

Tumbuhan membentuk protein dari CO2, H2O dan senyawa nitrogen. Hewan yang memakan tumbuhan mengubah protein nabati menjadi protein hewani. Di samping digunakan untuk pembentukan sel-sel tubuh, protein juga dapat digunakan sebagai sumber energi bila tubuh kita kekurangan karbohidrat dan lemak. Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat dalam protein ialah sebagai berikut: karbon 50%, hydrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0-3% dan fosfor 0-3%. Dengan berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16%, dapat dilakukan penentuan kandungan protein dalam suatu bahan makanan .

Protein memiliki molekul besar dengan berat molekul bervariasi antara 5000 hingga jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim, protein akan menghasilkan asam-asam amino. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein. Asam-asam amino ini terikat satu dengan lain oleh ikatan peptide. Protein mudh dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organik (Riawan, 1990)

Asam amino adalah senyawa yang mempunyai gugus karbkosil (-COOH) dan gugus amino (-NH2). Rumus umum untuk asam amino adalah:
NH2
H-C-COOH
R

Dari rumus umum tersebut dapat dilihat bahwa atom karbon alfa adalah atom karbon asimetrik, kecuali bila R adalah atom H. Oleh karena itu asam amino memiliki sifat memutar bidang cahaya terpolarisasi atau aktivitas optik. Oleh karena aton karbon asimetrik, maka molekul asam amino mempunyai dua konfigurasi D dan L. Molekul asam amino dikatakan mempunyai konfigurasi L apabila gugus –NH2 terdapat di sebelah kiri atom karbon alfa. Bila posisi gugus –NH2 di sebelah kanan, molekul asam amino itu memiliki konfigurasi D.

Hal ini seperti konfigurasi D-gliseraldehida yang memiliki gugus –OH di sebelah kanan atom karbon asimetrik. Asam-asam amino yang terdapat pada protein umumnya mempunyai konfigurasi L. Asam amino yang mempunyai konfigurasi D dapat diperoleh dari organisme mikro, misalnya D-asam glutamate dari Bacillus anthracis, D-alanin terdapat pula dalam dinding sel bakteri. D-asam amino dapat pula diperoleh sebagai hasil hidrolisis antibiotic gramisidin atau basitrasin. Konfigurasi asam amino tidak ada hubungannya dengan arah putaran cahaya terpolarisasi (Riawan, 1990).

Sifat-sifat Asam Amino

Seperti yang sudah diutarakan di atas, asam-asam alfa amino bersifat optis aktif kecuali glisin (asam amino asetat). Pada umumnya mereka larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organic non-polar seperti eter, aseton dan chloroform. Sifat asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan sifat amina. Asam karboksilat alifatik maupun aromatic yang terdiri atas beberapa atom karbon umumnya kurang larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik. Demikian pula amina pada umumnya tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik (Riawan, 1990).

Apabila asam amino larut dalam air, gugus karboksilat akan melepaskan ion H+, sedangkan gugus amina akan menerima ion H+ sebagaimana yang dituliskan di bawah ini
-COOH -COO- + H+
-NH2 + H+ -NH3

Oleh adanya kedua gugus tersebut, asam amino dalam larutan dapat membentuk ion yang bermuatan positif dan juga negatif (zwitterions) atau ion amfoter (Riawan, 1990). Bila kadar ion hydrogen meningkat, senyawa tersebut akan bersifat basa karena gugusan karboksilat akan mengikat ion H+ sehingga terbentuklah gugusan COOH yang tidak bermuatan.

Gugusan ammonium akan menyebabkan ion tersebut bermuatan positif (bentuk kation). Sebaliknya zwitterions akan bersifat asam karena gugus ammonium akan melepas ion H+ bila kadar ion H+ menurun, sehingga terbentuklah gugusan ammonium yang tidak bermuatan. Akibatnya molekul tersebut menjadi bermuatan negatif (bentuk anion) (Gilvery, 1996).

Dalam suatu sistem elektroforesis yang mempunyai elektroda positif dan negatif, asam amino akan bergerak menuju elektroda yang berlawanan dengan muatan ion asam amino yang terdapat dalam larutan.

Oleh karena muatan itu tergantung pada pH larutan, maka pH larutan dapat diatur sedimikian rupa sehingga ion asam amino tidak bergerak ke arah elektroda positif maupun elektroda negatif dalam sistem elektroforesis. pH yang demikian itu disebut titik isolistrik (Riawan, 1990).

Sebagian dari molekul-molekul mungkin mempunyai muatan negatif, tetapi segera diimbangi oleh molekul-molekul lain dengan muatan positif yang sama banyak: jumlah molekul zwitterions pada titik isolistrik adalah yang paling banyak (Gilvery, 1996).

Pada pH di atas titik isolistrik protein bermuatan negatif, sedangkan di bawah titik isolistrik protein bermuatan positif. Oleh karena itu untuk mengendapkan protein dengan ion logam diperlukan pH larutan di atas titik isolistrik, sedangkan pengendapan dengan ion negatif memerlukan pH di bawah titik isolistrik. Ion-ion positif yang mengendapkan protein antara lain Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, Cu++ dan Pb++.

Sedangkan ion-ion negatif yang dapat mengendapkan protein ialah ion salisilat, trikloroasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat. Berdasarkan sifat tersebut putih telur atau susu dapat digunakan sedagat antidote atau penawar racun apabila seseorang keracunan logam berat (Riawan, 1990).

Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam dua golongan besar, yaitu golongan protein sederhana dan protein gabungan. Protein sederhana adalah protein yang hanya terdiri atas molekul asam-asam amino, sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri atas protein dan gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas karbohidrat, lipid atau asam nukleat (Riawan, 1990).

Protein sederhana dapat dibagi dalam dua bagian menurut bentuk molekulnya, yaitu protein fiber dan protein globular. Protein fiber mempunyai bentuk molekul panjang seperti serat atau serabut, sedangkan protein globular berbentuk bulat (Riawan, 1990).

Molekul protein fiber terdiri atas beberapa rantai polipeptida yang memanjang dan dihubungkan satu sama lain oleh beberapa ikatan silang sehingga merupakan bentuk serat atau serabut yang stabil. Sifat umum protein fiber ialah tidak larut dalam air dan sukar diuraikan dengan enzim (Riawan, 1990).

Kolagen adalah suatu jenis protein yang terdapat pada jaringan ikat. Protein ini mempunyai struktur heliks tripel. Kolagen tidak larut dalam air dan tidak diuraikan dengan enzim. Namun kolagen dapat diubah oleh pemanasan dalam air mendidih oleh larutan asam atau basa encer menjadi gelatin yang mudah larut dan mudah dicernakann. Hampir 30% protein tubuh adalah kolagen (Riawan, 1990).

Keratin adalah protein yang terdapat dalam bulu domba, sutera alam, rambut, kulit, kuku. Apabila dipanaskan dengan air mendidih dan diregangkan maka konformasi berubah menjadi lembaran berlipat parallel, karena ikatan hydrogen yang menunjang struktur terputus (Riawan, 1990).

Protein globular umumnya berbentuk bulat atau elips dan terdiri atas rantai polipeptida yang berlipat. Pada umumnya gugus R polar terletak di sebelah luar rantai peptida, sedangkan gugus R yang hidrofob terletak di sebelah dalam molekul protein. Protein globular pada umumnya mempunyai sifat dapat larut dalam air, dalam larutan asm dan basa dan etanol. Beberapa jenis protein globular adalah albumin, globulin, histon dan protemin (Riawan, 1990).

Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas. Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan amonium sulfat hingga jenuh. Albumin antara lain terdapat pada serum darah dan bagian putih telur (Riawan, 1990).

Globulin mempunyai sifat sukar larut dalam air murni, tetapi dapat larut dalam larutan garam netral, misalnya larutan NaCl encer. Larutan globulin dapat diendapkan oleh penambahan garam amonium sulfat hingga setengah jenuh. Globulin dapat diperoleh dengan jalan mengekstrasikannya dengan larutan garam (5-10%) NaCl, kemudian ekstrak yang diperoleh diencerkan dengan penambahan air. Seperti albumin, globulin juga dapat terkoagulasi oleh panas. Globulin antara lain tertdapat dalam serum darah, pada otot dan jaringan lain (Riawan, 1990).

Protein gabungan adalah protein yang berikatan dengan senyawa yang bukan protein. Gugus bukan protein ini disebut gugus prostetik. Ada beberapa jenis gabungan antara lain mukoprotein, glikoprotein, lipoprotein dan nucleoprotein (Riawan, 1990).
Reaksi warna untuk asam amino spesifik

Alat dan Bahan

Alat - Alat

Tabung reaksi
Rak tabung reaksi
Pengangas air
Alat vortex
Gelas ukur
Pipet tetes
Gelas pengukur
Lampu spiritus dan penjepit tabung

Bahan-bahan

Larutan encer protein (albumin)
Larutan ZnSO4
Asam sulfosalisilat 20%
Larutan esbach
Kalium ferosianida 5%
Asam asetat glasial
Asam wolframat
Asam metafosfat
Larutan (NH4)SO4
Alkohol pekat, KOH 10%
Larutan kasein 2%
Larutan ninhidrin 0,1%,
Larutan triptofan 0,01%
Larutan merkurisulfat 1%
Larutan NaNO2
Larutan formaldehida encer
Larutan H2SO4
Larutan HNO3 pekat
Larutan amoniak
Klorofenol merah
Na2CO3 2%
HNO3 encer
Larutan Na-hipobromida
Asam sulfosalisilat
Larutan kasein encer
Indikator brom kresel hijau
Asam asetat 2%
Larutan molibdat
Gelatin
Es batu
Larutan amonium sulfat ferosianida.

Cara Kerja

Pengendapan

1.1 Pengendapan dengan menggunakan logam berat melalui tahap-tahap sebagai berikut : ke dalam 2 cc larutan encer protein (albumin) ditambahkan setetes demi setetes larutan ZnSO4 encer, setelah itu catat perubahan yang terjadi, kemudian tambahkan pereaksi tersebut sampai berlebihan, endapan yang terjadi akan larut kembali.

1.2 Pengendapan dengan menggunakan pereaksi alkaloid adalah sebagai berikut : ke dalam empat tabung yang berbeda, masing-masing dimasukkan 2 ml larutan encer protein (albumin). Kemudian pada tabung pertama ditambahkan pereaksi 1-2 tetes asam sulfoslisilat 20%, pada tabung kedua ditambahkan esbach sebanyak 2 ml, pada tabung ketiga ditambahkan kalium ferosianida dan 5 tetes asam asetat glasial tetes demi tetes hingga berlebihan, pada tabung keempat ditambahkan asam wolframat dan asam metafosfat hingga terbentuk endapan. Setelah itu amati perubahan yang terjadi pada masing-masing tabung.

1.3 Pengendapan dengan menggunakan garam netral dan alkohol melalui tahap-tahap sebagai berikut: tambahkan (NH4)2SO4 padat ke dalam 5 ml larutan protein encer (albumin). Lama-kelamaan akan terjadi endapan yang jika diencerkan akan larut kembali. Pada tabung yang berbeda, masukkan satu hingga dua tetes larutan protein pekat dan 2 ml alkohol pekat. Endapan yang terjadi akan larut kembali jika diencerkan.

Reaksi warna

2.1 Uji Biuret
Dua millimeter larutan protein encer (albumin) dalam tabung reaksi dituangi dengan 2 ml KOH 10% (atau 1 ml NaOH 40%). Tambahkan beberapa tetes CuSO4 0,1%, setelah itu amati warnanya.

2.2 Uji Ninhidrin
Ke dalam tabung reaksi yang berisi 4 ml larutan kasein 2% ditambahkan 1 ml larutan 0,1% ninhidrin. setelah divortex, didihkan dengan menggunakan lampu spirtus selama 1 menit. Kemudian dicatat warna yang timbul.

2.3 Uji Triptofan
0,4 ml larutan triptofan 0,01% dalam tabung reaksi ditambahkan dengan pereaksi C setelah itu campuran tersebut dipanaskan pada suhu 65oC selama 15 menit dalam penangas air. Kemudian perubahan yang timbul diamati.

2.4 Uji Millon
Dalam 1 ml larutan protein encer ditambahkan 1 ml larutan merkurisulfat, setelah dipanaskan hingga mendidih, perubahan yang terjadi diamati. Setelah itu didinginkan di bawah air mengalir dan ditambahkan setetes demi setetes laritan NaNO2 1%, kemudian panaskan kembali dan diamati perubahannya.

2.5 Triptofan (Hopkins-Cole)
Dituangkan 1 ml larutan protein encer (albumin) dengan 1 ml larutan formaldehida encer pada tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 1 ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung sehingga terbentuk dua lapisan. Kemudian perubahan yang terjadi diamati dan setelah itu tabung digojok.

2.6 Xanthoprotein
Sebuah tabung reaksi diisi dengan 3 ml larutan protein dan I ml HNO3 pekat, kemudian campuran tersebut dididihkan dan kemudian langsung didinginkan. Isi tabung tersebut dibagi ke dalam dua tabung yang berbeda. Pada salah satu tabung diisi dengan amoniak. Amati perubahan yang terjadi dan dibandingkan.

Semua percobaan uji warna dilakukan pada larutan protein encer (albumin) dan gelatin.

Hidrolisis Protein

3.1 Metaprotein
Ke dalam tabung reaksi dituangkan 5 ml larutan protein (asam) dan setetes klorofenol merah sehingga larutan menjadi kuning. Kemudian ditambahkan Na2CO3 2% hingga tercapai titik isolistrik (pada pH 5,4 dan warna larutan menjadi merah muda). Perubahan yang terjadi diamati. Setelah itu larutan dibagi menjadi dua tabung. Tabung pertama dimasak dan kemudian dibagi menjadi dua tabung lagi. Tabung yang pertama dari tabung yang pertama dituangi satu tetes HNO3 encer dan tabung kedua dari tabung pertama dituangi dengan 1 hingga 2 tetes Na2CO3. Kemudian dicatat perubahan kelarutannya. Tabung kedua ditambahkan Na2CO3 secara berlebihan dan kemudian dicatat perubahnnya.

3.2 Proteosa
Ke dalam beberapa ml larutan protein encer (albumin) tambahkan larutan (NH4)2 SO2 hingga jenuh dan kemudian didihkan. Pisahkan endapan yang terjadi kemudian endapan dilarutkan dengan air panas dan digojok. 1 ml larutan itu diuji dengan menggunakan uji biuret dan sisa filtratnya diuji dengan panas dan ferosianida.

Perbedaan sifat bermacam-macam protein

4.1 Albumin dan Globulin
Ke dalam dua tabung reaksi yang masing-masing berisi 2 ml serum encer ditambahkan 1 sampai 2 tetes asam sulfosalisilat pada tabung pertama dan 1 tetes klorofenol merah pada tabung yang kedua. Kemudian warna endapan yang terjadi dicatat. Pada tabung kedua ditambahkan asam asetat 2% dengan hati-hati hingga warna larutan hilang. Kemudian tabung kedua tersebut dimasak. Maka akan terjadi endapan. Setelah itu tabung kedua didinginkan. Larutan tadi dibagi ke dalam dua tabung yang berbeda. Pada tabung pertama ditambahkan 2 ml asam nitrat encer dan pada tabung kedua ditambahkan 2 ml Na2CO3 encer. Perubahan yang terjadi diamati.

4.2 Kasein
Ke dalam sebuah tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan kasein encer yang alkalis ditambahkan indicator brom kresel hijau. Kemudian setetes demi setetes asam asetat 2% ditambahkan hingga warna larutan menjadi agak kehijau-hijauan. Endapan yang terjadi dicatat.

4.3 Uji Newman terhadap P dalam Kasein
Ke dalam tabung reaksi yang berisi 2 ml kasein dituangkan 5 tetes HNO3 pekat dan 10 tetes H2SO4 pekat. Kemudian tabung dipanaskan pada lampu spirtus hingga keluar asap putih. Amati perubahan warna yang terjadi. Jika masih berwarna coklat atau hitam, maka dengan hati-hati asam sulfat pekat dialirkan melalui dinding tabung secara hati-hati. Kemudian larutan dipanaskan kembali hingga tidak berwarna. Tabung didinginkan dan sesudah itu ditambahkan ammonium molibdat 2 ml. Setelah itu panaskan hingga 10 menit dan catat warna endapan yang terjadi.

4.4 Gelatin
Sedikit gelatin dicampurkan dengan 10 ml air dalam sebuah tabung. Campuran tersebut digojok hingga homogen. Setelah itu larutan dimasah pada penangas air selama 10 menit. Dan sesudah itu larutan didinginkan dalam es batu. Kemudian, gelatin diambil sebanyak 5 ml dan di tambahkan 1 ml ammonium sulfat ferosianida dan asam asetat beberapa tetes. Amati perubahan yang terjadi.

Sesudah itu, gelatin yang tersisa dilakukan uji warna dan penambahan ammonium sulfat padat.

Hasil Pengamatan

Pengendapan

1.1 Dengan menggunakan logam berat

Tabung 1. Larutan yang terjadi keruh setelah ditetesi sebanyak 13 kali dan warna endapannya menjadi putih encer. Setelah tetesan yang ke -50 endapan putih hilang dan warna larutan menjadi bening.

Tabung 2. larutan menjadi keruh dan terjadi endapan putih setelah ditetesi 10 tetes, setelah tetesan ke 40 larutan menjadi bening namun masih terdapt endapan.

Albumin dengan kasein akan mengalami pengendapan karena mengalami titik isolistrik akibat reaksi antara albumin dan kasein (basa sehingga laritan bermuatan negatif) dengan Zn mengakibatkan terjadinya denaturasi dan koagulasi. Warna keruh disebabkan karena terjadi ikatan antara Zn dengan albumin menjadi Zn proteinat, Zn dapat menjenuhkan larutan hingga pH larutan berada di atas pH isolistrik sehingga gumpalan larut kembali. Hal ini sesuai dengan dasar teori yang dikemukakan oleh Riawan (1990), yang menyatakan bahwa logam berat dapat mengendapkan protein dengan cara menaikkan pH di atas titik isolistrik.

1.2 Pengendapan dengan garam netral dan alkohol

Tabung 1. sebelum dikocok, ada endapan albumin di dasar tabung dan setelah dikocok, endapan larut kembali

Tabung 2. warna larutan menjadi keruh setelah larutan albumin dicampur dengan alcohol panas. Setelah tetesan aquades yang ke 70, warna larutan menjadi agak bening

Albumin mengalami denaturasi akibat adanya pengocokan dengan kuat. Denaturasi adalah perubahan dalam struktur sekunder, tersier dan kkuartener dari suatu protein, baik itu dalam bentuk enzim maupun hormon. Karena ikatan peptide tidak pecah, maka struktur primer tidak terganggu. Selain dengan pengocokan yang kuat, denaturasi juga bias terjadi melalui kondisi adanya penambahan larutan organik, garam dari logam berat, larutan urea dan lain-lain. Pada percobaan di atas, albumin mengalami denaturasi sebab garam netral yang digunakan (ammonium sulfat) dan senyawa organic (alkohol pekat) bersifat higroskopis yang dapat mengikat air. Molekul air dalam albumin diikat oleh garam dan alcohol pekat sehingga albumin tersebut menggumpal. Setelah pengocokan kuat dan penambahan aquades, endapan akan larut kembali karena albumin sudah mendapatkan molekul air dari aquades yang ditambahkan. Hal ini sesuai dengan tinjauan pustaka yang menyatakan bahwa salah satu sifat protein adalah mengalami denaturasi dan koagulasi.

1.3 Pengendapan dengan menggunakan alkaloid

Tabung 1. Pada hasil percobaan, warna larutan menjadi berwarna putih susu.
Tabung 2. Pada hasil percobaan, terjadi endapan berwarna kuning.
Tabung 3. Terjadi endapan putih
Tabung 4. Terjadi endapan dengan asam wolframat tetes

Albumin akan mengalami pengendapan karena mengalami titik isolistrik akibat reaksi antara albumin degan ion-ion negatif mengakibatkan terjadinya denaturasi dan koagulasi. Warna keruh disebabkan karena terjadi ikatan antara ion salisilat dengan albumin, ion-ion negatif dapat menjenuhkan larutan hingga pH larutan berada di bawah pH isolistrik sehingga gumpalan larut kembali. Hal ini sesuai dengan dasar teori yang dikemukakan oleh Riawan (1990), yang menyatakan bahwa logam berat dapat mengendapkan protein dengan cara menurunkan pH di bawah titik isolistrik.

Reaksi Warna

2.1 Uji Biuret

Uji Biuret pada gelatin

Setelah 10 tetes mulai berubah warna (terbentuk cincin ungu), setelah pemberian 13 tetes CuSO4 mulai terdapat cincin ungu di permukaan tabung.

Terjadinya cincin ungu terbentuk dari ikatan antara Cu dan N, unsur N terdapat pada peptida; menghasilkan CuN yang terjadi dalam suasana basa (melalui penggunaan KOH atau NaOH). Makin panjang suatu ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk makin jelas dan makin tua. Pada hasil percobaan, apabila tabung reaksi digoyang maka cincin ungunya akan hilang menyebar yang berarti ikatan peptidanya lepas dan tidak kuat. Uji biuret berlaku untuk senyawa yang mempunyai ikatan peptida lebih dari satu. Hasil percobaan ini sesuai dengan tinjauan pustaka Riawan (1990) yang menyatakan bahwa protein memiliki ikatan peptida yang ditunjukkan dengan adanya cincin ungu.

Uji Biuret pada albumin

Setelah pemberian KOH 10%, terjadi gumpalan putih susu. Setelah penambahan CuSO4 mulai terdapat cincin ungu muda di permukaan tabung.

Terjadinya cincin ungu terbentuk dari ikatan antara Cu dan N, unsur N terdapat pada peptida; menghasilkan CuN yang terjadi dalam suasana basa (melalui penggunaan KOH atau NaOH). Makin panjang suatu ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk makin jelas dan makin tua. Pada hasil percobaan, apabila tabung reaksi digoyang maka cincin ungunya akan hilang menyebar yang berarti ikatan peptidanya lepas dan tidak kuat. Uji biuret berlaku untuk senyawa yang mempunyai ikatan peptida lebih dari satu. Hasil percobaan ini sesuai dengan tinjauan pustaka Gilvery (1996) yang menyatakan bahwa protein memiliki ikatan peptida yang ditunjukkan dengan adanya cincin ungu.

2.2. Uji Millon

Uji Millon pada gelatin

Sebelum penambahan larutan NaNO3 tidak terdapat endapan dan tidak terjadi perubahan warna. Setelah penambahan warna larutan menjadi putih dan tidak ada endapan

Percobaan ini kurang berhasil karena seharusnya Hg yang terdapat pada HgSO4 berikatan dengan NaNO3 membentuk kompleks warna merah. Kegagalan percobaan ini mungkin karena pipet yang digunakan kurang bersih atau sudah terkontaminasi dengan larutan lain. Penambahan tetes NaNO3 mungkin juga tidak sama dengan prosedur yang seharusnya dilakukan. Pada percobaan yang benar, seharusnya tidak terdapat warna merah yang merupakan indikasi adanya asam amino tirosin. Karena protein yang digunakan adalah gelatin dan gelatin tidak mengandung asam amino tersebut, maka uji Millon tersebut berhasil negatif.

Uji Millon pada albumin

Sebelum penambahan larutan NaNO3 tidak terdapat endapan dan tidak terjadi perubahan warna. Setelah penambahan warna larutan menjadi putih keruh dan ada endapan berwarna merah.

Pada percobaan terdapat warna merah yang merupakan indikasi adanya asam amino tirosin. Endapan merah yang terjadi tersebut karena merkuri berikatan dengan hiroksi dari albumin menjadi HgNO3. Karena protein yang digunakan adalah albumin dan albumin mengandung asam amino tersebut, maka uji Millon tersebut berhasil positif. Hal ini sesuai dengan tinjauan pustaka Harper (1980) yang menyatakan bahwa reaksi warna Millon bertujuan untuk mengetahui adanya asam amino tirosin yang ditandai adanya warna endapan merah.

2.3 Uji Hopskin Cole

Uji Hopskin Cole pada gelatin

Pada hasil percobaan, sebelum tabung reaksi digojog, terbentuk cincin ungu. Setelah digojok, cincin ungu memudar dan warna larutan menjadi bening.

Uji Hopskin Cole bertujuan untuk mengetahui apakah dalam suatu zat dan senyawa terdapat asam amino triptofan atau tidak. Pada percobaan ini terdapan warna ungu yang merupakan indikasi adanya gugus triptofan pada gelatin. Untuk mengetahui apakah terdapat asam amino ini, dengan penambahan formaldehida, aldehid akan berikatan dengan gugus indol asam amino triptofan membentuk cincin ungu. Percobaan ini sesuai dengan tinjauan pustaka Harper, 1980 yang menyatakan bahwa reaksi warna Hopskin Cole, bertujuan untuk mengetahui adanya gugus triptofan yang jika berhasil positif, maka akan menunjukkan indikasi warna ungu.

Uji Hopskin Cole pada albumin

Pada hasil percobaan, sebelum tabung reaksi digojog, terbentuk cincin ungu yang tipis. Setelah digojok, terdapat endapan yang berwarna bening ungu.

Uji Hopskin Cole bertujuan untuk mengetahui apakah dalam suatu zat dan senyawa terdapat asam amino triptofan atau tidak. Pada percobaan ini terdapan warna ungu yang merupakan indikasi adanya gugus triptofan pada albumin. Untuk mengetahui apakah terdapat asam amino ini, dengan penambahan formaldehida, aldehid akan berikatan dengan gugus indol asam amino triptofan membentuk cincin ungu. Percobaan ini sesuai dengan tinjauan pustaka Harper, 1980 yang menyatakan bahwa reaksi warna Hopskin Cole, bertujuan untuk mengetahui adanya gugus triptofan yang jika berhasil positif, maka akan menunjukkan indikasi warna ungu.

2.4 Uji Xanthoprotein

Uji Xanthoprotein pada gelatin

Pada hasil percobaan terdapat endapan putih setelah dilakukan pemanasan. Pada tabung pertama yang ditambah dengan amoniak, warna larutan menjadi berwarna kuning, sedangkan tabung kedua yang tidak ditambah amoniak tidak berwarna.

Pada dasarnya, uji Xanthoprotein bertujuan untuk mengetahui adanya gugus aromatic (benzene) yang berupa asam amino tirosin, triptofan dan fenilalanin. Pada uji ini terbentuk warna kuning yang merupakan indikator adanya asam amino-asam amino tersebut. Hal ini sesuai dengan dasar teori dan tinjauan pustaka Harper, 1980 yang menyatakan bahwa reaksi warna Xanthoprotein bertujuan untuk mengetahui adanya gugus aromatik asam amino yang memiliki gugus aromatik (benzene) yang ditunjukkan dengan adanya warna kuning.

Uji Xanthoprotein pada albumin

Pada hasil percobaan terdapat endapan putih susu setelah dilakukan pemanasan. Pada tabung pertama yang ditambah dengan amoniak, warna larutan menjadi berwarna kuning, sedangkan tabung kedua yang tidak ditambah amoniak tidak berwarna.

Pada dasarnya, uji Xanthoprotein bertujuan untuk mengetahui adanya gugus aromatic (benzene) yang berupa asam amino tirosin, triptofan dan fenilalanin. Pada uji ini terbentuk warna kuning yang merupakan indikator adanya asam amino-asam amino tersebut. Hal ini sesuai dengan dasar teori dan tinjauan pustaka Harper, 1980 yang menyatakan bahwa reaksi warna Xanthoprotein bertujuan untuk mengetahui adanya gugus aromatik asam amino yang memiliki gugus aromatik (benzene) yang ditunjukkan dengan adanya warna kuning.

2.5 Uji Molisch

Uji Molisch pada gelatin

Pada hasil percobaan tidak terdapat cincin ungu, warna yang terjadi malah hijau tua

Uji Molisch bertujuan untuk mengetahui adanya sakarida dan glikosida pada suatu senyawa protein. Hasil yang positif seharusnya berwarna ungu. Pada hasil percobaan, warna yang terjadi adalah hijau tua yang kemungkinan terjadi kontaminasi pipet atau gelatin yang digunakan terlalu sedikit sehingga tidak tercapai efek yang diinginkan. Kadar karbohidrat dalam gelatin sedikit. Karbohidrat dengan penambahan asam pekat mengalami dehidrasi menjadi furfural. Jika furfural ditambahkan Molisch (α-naphto) akan mengalami kondensasi yang membentuk cincin ungu. Hal ini sesuai dengan tinjauan pustaka yang digunakan (Harper, 1980) yang menyatakan bahwa uji Molisch memberikan reaksi warna jika direaksikan dengan protein yag mengandung gugus sakarida.

Uji Molisch pada albumin

Pada hasil percobaan setelah ditambah dengan reagen molisch terjadi perubahan warna coklat susu di bawahnya terjadi endapan putih. Selain itu terdapat endapan ungu kehitaman
Uji Molisch bertujuan untuk mengetahui adanya sakarida dan glikosida pada suatu senyawa protein. Hasil yang positif seharusnya berwarna ungu. Pada hasil percobaan, warna yang terjadi. Karbohidrat dengan penambahan asam pekat mengalami dehidrasi menjadi furfural. Jika furfural ditambahkan Molisch (α-naphto) akan mengalami kondensasi yang membentuk cincin ungu. Hal ini sesuai dengan tinjauan pustaka yang digunakan (Harper, 1980) yang menyatakan bahwa uji Molisch memberikan reaksi warna jika direaksikan dengan protein yag mengandung gugus sakarida.

Perbedaan sifat protein

Albumin dan globulin

Tabung 1. Pada hasil percobaan larutan yang terjadi adalah keruh dan terdapat endapan berwarna putih
Tabung 2. Setelah penambahan klorofenol red, warna larutan menjadi merah hati
Tabung A. Setelah penambahan asam asetat 2% dan penambahan asam nitrat 2 ml, larutan menjadi kuning keruh dan endapan yang terjadi tidak larut kembali
Tabung B. Setelah penambahan asam asetat 2% dan penambahan Na2CO3 encer, larutan menjadi keruh dan ada endapan yang tidak larut.

Serum adalah gabungan dari albumin dan globulin. Asam sulfosalisilat adalah alkaloid yang bersifat asam dan mengikat protein. Pada albumin, kelarutan protein rendah sehingga mengendap. Pada tabung kedua penambahan klorofenol pada serum yang mengakibatkan perubahan warna larutan menjadi merah hati menunjukkan bahwa pH serum bersifat basa. Klorofenol merupakan indicator pH yang akan berubah warna merah jika larutan bersifat basa dan akan berwarna kuning jika larutan bersifat asam. Pada tabung A maupun B terjadi endapan hasil pemanasan yang tidak larut dalam kedua asam yang digunakan (asam nitrat dan Na2CO3). Endapan tersebut disebut koagulan. Sifat protein yang mengalami koagulasi (denaturasi protein y ang bersifat irreversible dan permanent) sesuai dengan tinjauan pustaka yang menyatakan bahwa protein memiliki sifat dapat mengalami koagulasi.

Kasein

Dengan penambahan asam asetat sebanyak 14 tetes tidak terjadi perubahan warna dan tidak terjadi endapan.

Uji Newman terhadap kasein

Setelah dipanaskan di atas api, larutan menjadi bening dan mengeluarkan asap putih Larutan menjadi tiga lapis yaitu dari atas ke bawah : bening, putih dan kuning. Setelah didinginkan dan ditambah dengan ammonium molibdat mengeluarkan warna kuning kehijauan.

Bromkresol hijau merupakan indikator asam basa yang jika ditempatkan pada lingkungan sedikit asam ataupun basa maka akan berwarna hijau dan jika ditempatkan di lingkungan asam akan berwarna kuning. Tujuan dari penambahan asam asetat dan NaOH encer adalah untuk menggumpalkan kasein pada pH isolistriknya (sekitar 4,6) NaOH yang bersifat basa dan asam asetat yang bersifat asam akan menyebabkan kasein menemukan pH isolistriknya.

Pada uji Newman terhadap kasein, kasein mengalami denaturasi dengan penambahan HNO3 dan H2SO4. Ketika dipanaskan larutan akan mengeluarkan asap, fosfor yang terlepas dari kasein menyebabkan ia menjadi asam fosfat yang berwarna kuning.

Reaksi pengendapan gelatin cair

Pada hasil percobaan terdapat endapan gelatin

Gelatin mengalami denaturasi setelah ditambahi ammonium sulfat atau kalium ferrosianida. Ammonium sulfat adalah salah satu garam yang bersifat higroskopis yang dapat menyerap air.

Kesimpulan

Protein dapat memberikan reaksi pengendapan untuk logam berat, alkohol pekat, garam dan reagen-reagen alkaloid untuk dasar reaksi penetralan muatan, denaturasi, penarikan gugus air dan titik isolistriknya. Terdapat reaksi-reaksi spesifik untuk protein yang dapat digunakan untuk identifikasi kandungan protein antara lain uji biuret yang bertujuan untuk menunjukkan adanya ikatan peptide, reaksi millon yang spesifik untuk tiroksin (gugus hidroksifenol) dan reaksi triptofan hopskin cole yang spesifik untuk triptofan.

Melalui percobaan tersebut dapat diketahui adanya sifat-sifat protein yaitu mengendap dengan reagen esbach, mengendap dengan alkohol pekat, memberi hasil positif terhadap reaksi biuret. Dalam suasana basa, protein bermuatan negatif dan sebaliknya, dalam suasana asam, protein bermuatan positif.

Denaturasi dapat terjadi karena pemanasan dan penambahan asam atau basa. Mekanisme penyakit dapat dijelaskan dengan pendekatan biokimia.
http://www.gudangmateri.com/2010/02/biokimia-protein.html

Pembahasan
Pada berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein, semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein, yaitu asam amino tentunya. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui komponen asam amino suatu protein.
Prinsip dari uji millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin dan kasein mengandung Tirosin sebagai salah asam amino penyusunnya, sedangkan gelatin dan pepton tidak. Fenol dalam hal ini digunakan sebagai bahan percobaan karena Tirosin memiliki molekul fenol pada gugus R-nya. Di sini, uji terhadap fenol negatif, walaupun secara teori tidak. Alasan yang mungkin untuk hal ini adalah kesalahan praktikan dalam bekerja.
Pada uji Hopkins cole, uji positif ditunjukkan oleh albumin, gelatin, kasein, dan pepton, dengan ditunjukkan oleh adanya cincin berwarna ungu. Uji ini spesifik untuk protein yang mengandung Triptofan. Triptofan akan berkondensasi dengan aldehid bila ada asam kuaat sehngga membentuk cincin berwarna ungu.
Protein yang mengandng sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk persenyawaan berwarna. Uji ini bersifat umum untuk semua asam amino, dan menjadi dasar penentuan kuantitatif asam amino. Pada uji ini, hanya kasein yang menunjukkan uji negatif terhadap ninhidrin. Hal ini disebabkan karena pada kasein tidak mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan amino yang terbuka.
Sistein dan Metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya.. Reaksi Pb-asetat dengan asam-asam amino tersebut akan membentuk endapan berwarna kelabu, yaitu garam PbS. Penambahan NaOH dalam hal ini adalah untuk mendenaturasikan protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS. Dari semua bahan yang diuji, hanya albumin yang membentuk endapan PbS, sehingga dapat disimpulkan albumin mengandung Sistein ataupun Metionin.
Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena. Fenilalanin, Tirosin, dan Triptofan yang mengandung inti benzena pada molekulnya juga mengalami reaksi dengan HNO3 pekat. Untuk perbandingan, dapat ditunjukkan oleh fenol yang bereaksi membentuk nitrobenzena. Hasil uji menunjukkan bahwa dari semua bahan, hanya kasein yang tidak mengandung asam amino yang mempunyai inti benzena pada molekulnya. Tetapi hal ini patut dipertanyakan, karena dari data-data yang diperoleh pada uji millon dan uji Hopkins cole, kasein mengandung tirosin dan triptofan. Salah satu alasan yang mungkin adalah karena kesalahan kerja praktikan dalam mengamati warna yang terbentuk selama reaksi.
Pada uji biuret, semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein. Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus -CO dan -NH pada molekulnya.
Protein yang tercampur oleh senyawa logam berat akan terdenaturasi. Hal ini terjadi pada albumin yang terkoagulasi setelah ditambahkan AgNO3 dan Pb-asetat. Senyawa-senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein membentuk endapan logam proteinat. Protein juga mengendap bila terdapat garam-garam anorganik dengan konsentrasi yang tinggi dalam larutan protein. Berbeda dengan logam berat, garam-garam anorganik mengendapkan protein karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein untuk mengikat air. Pada percobaan, endapan yang direaksikan dengan pereaksi millon memberikan warna merah muda, dan filtrat yang direaksikan dengan biuret berwarna biru muda. Hal ini berarti ada sebagian protein yang mengendap setelah ditambahkan garam.
Pada uji koagulasi, endapan albumin yang terjadi setelah penambahan asam asetat, bila direaksikan dengan pereaksi millon memberikan hasil positif. Hal ini menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perrubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan struktur tesier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air.
Pada uji pengendapan oleh alkohol, hanya tabung-tabung yang mengandung asam (ber-pH rendah) yang menunjukkan pengendapan protein. Pada protein, ujung C asam amino yang terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam membentuk senyawa protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukkan oleh adanya endapan yang terbentuk.
Protein akan terdenaturasi atau mengendap bila berada pada titik isolistriknya, yaitu pH dimana jumlah muatan positif sama dengan jumlah muatan negatifnya. Pada uji denaturasi, protein yang dilarutkan dalam buffer asetat pH 4,7 menunjukkan adanya endapan. Protein yang dilarutkan dalam HCl maupun NaOH, keduanya tidak menunjukkan adanya pengendapan, namun setelah ditambahkan buffer asetat dengan volume berlebih, protein pun mengendap hal ini menunjukkan bahwa protein albumin mengendap pada titik isolistriknya, yaitu sekitar pH 4,7.
Kesimpulan
Protein dan asam amino memberikan reaksi yang bersifat khas, bukan hanya bagi gugus amino dan gugus karboksil bebas, tetapi juga bagi gugus R yang terkandung di dalamnya. Protein dapat bereaksi dengan pereaksi-pereaksi lain seperti juga asam amino yang menjadi penyusunnya. Protein dapat mengendap atau terdenaturasi oleh logam berat, garam-garam anorganik, rusaknya struktur tersier dan kwartener, serta karena berada pada titik isolistriknya.

Posted in: biokimia